牙齿缺失会损害咀嚼、说话甚至社交的能力，从而直接影响生活品质。种植牙凭借其功能和生物学优势，以及较高的长期成功率（95%以上），已被大多数患者视为首选。足够的骨量是种植治疗成功的先决条件；然而，据报道，超过一半的患者在种植手术之前/期间有必要进行骨移植。目前的统计多个方面数据显示，全球每年将进行约 220 万例骨移植手术，预计到 2021 年将花费 6.64 亿美元，并且预计该数字每年将增长约 13%。理想的颅面骨修复移植物不仅应注重修复能力，还应注重自然结构的再生和咬合负荷相关功能的恢复。然而，此类功能性骨组织工程支架却鲜有报道。

  来自浙江大学的学者提出了一种分层 3D 移植物来重建具有自然结构和健康生物功能的颅面骨。受骨愈合过程的启发，本研究开发了一种含有超小型磷酸钙低聚物和骨形态发生蛋白-2的有机-无机纳米墨水，可用于新骨的时空引导。基于这种均匀的纳米墨水，通过基于投影的3D打印方法制造了仿生移植物，包括含有哈弗系统的皮质层和具有三周期最小表面宏观结构的松质层，并且这些层加载了不同浓度的生物活性物质梯度密度再生新骨的因素。该移植物在体外表现出优异的成骨和血管生成潜力，并在体内加速血运重建并重建具有原始形态的新生骨。受益于这种自然结构，负载力可以广泛传递，同时减少了植入牙种植体周围的应力集中。这项研究从天然的生理化学和结构线索出发，通过设计功能导向的生物材料，为功能性组织工程提供了一种新的策略。与之相类似的文章以“A Hierarchical 3D Graft Printed with Nanoink for Functional Craniofacial Bone Restoration”标题发表在Advanced Functional Materials。

  图 1. 分层 3D 移植和纳米墨水可印刷性探索的设计。A) 仿生移植物的皮质层 a) 和松质层 b) 是由基于投影的3D 打印机 c-e) 设计和打印的。GFP-HUVEC 接种在皮质通道内，RFP-BMSC 位于表面，如 f) 和g) 中的共焦图像所示。将两种细胞均匀接种在松质层上，如 h) 所示。B) 带有尺寸分布插图的 CPO TEM 图像。C、D) 显示了掺有不同含量 CPO 和 ACP 的 GM 的流变测试。E) 可见光绕过不同墨水的插图和数码照片。F) 初始光路内的剩余可见光和 G) 通过动态光散射量化的散射光 (n = 3)。H) 标准化放射状图案结构a)，并测量结构的内径“d”和外径“D”以进行精度评估b) (n = 3)。

  图 2.有机-无机复合水凝胶的物理化学表征。A) 具有不一样 CPO 含量的水凝胶的代表性 SEM 图像和元素图，B) 相应的 FTIR 光谱。C）打印复合水凝胶的压缩应力-应变曲线。D) 压缩模量表示通过印刷和铸造制备的水凝胶的 0–10% 压缩应力-应变曲线)。E) 降解 (n = 5)，F) BMP-2 和 G) 不同水凝胶的Ca2+ 释放曲线)。F) 中的插图显示了最初 10 天内的释放行为。

  图 3. 使用 BMSC 测试的具有梯度 BMP-2 和 CPO 的水凝胶的相容性和成骨潜力。A) 第 3 天的活/死染色和 B) 在各种水凝胶上培养 1、3、5 和 7 天的 BMSC 的 CCK8 分析 (n = 3)。C）不同水凝胶上培养1天的细胞形态观察（肌动蛋白丝被染成绿色，细胞核被染成蓝色）。D) 在第 7 天用不同水凝胶培养的BMSC 的大体视图（插图）和 ALP 染色的显微图像，E) 定量测量 (n = 3)。F) 第 14 天时孔中培养的 BMSC 的 ARS 染色的大体视图（插图）和显微图像，G) 定量测量 (n = 3)。H) 7 天和 14 天时各种水凝胶对 BMSC 成骨基因表达的影响 (n = 3-4)。I) 水凝胶培养3天后，通过ELISA测定BMSCs分泌的VEGF浓度(n = 3)。J) 各种水凝胶对BMSC 中血管生成基因表达的影响 (n = 3–4)。

  图 4. 从与不同水凝胶培养的 BMSC 中提取的条件培养基的相容性和血管生成潜力，并用 HUVEC 来测试。A) 第 3 天的活/死染色（绿色，活细胞；红色，死细胞）和 B) 使用不相同条件培养基培养 1、3、5 和 7 天的 HUVEC 的 CCK8 分析 (n = 3)。C) 0、12 和 24 小时时划伤伤口愈合测定的代表性图像，D) 通过显微照片确定的伤口汇合百分比和伤口宽度 (n = 3)。E) 24 小时 Transwell 迁移测定的代表性图像和 F) 通过结晶紫染色确定的迁移 HUVEC 的定量分析 (n = 3)。G) 孵育 6 小时后 HUVEC 的管状网络形成和 H) 血管生成参数的定量评估，包括连接处、网状结构和节点的数量 (n = 5)。I) 3 天时条件培养基对 HUVEC 血管生成基因表达的影响 (n = 5-6)。

  图 6. 植入兔下颌骨缺损的不同移植物的影像分析。A) 兔下颌骨缺损及手术过程示意图，其中植入a)块状水凝胶(block)、b)仿生水凝胶(biomimetic)、c)Bio-Oss颗粒(Bio-Oss)，未进行任何处理对照组。B) 使用矢状面和横截面图像进行 Micro-CT 3D 重建；红色框定义缺陷边缘。C) 治疗后 6 周和 12 周时对缺损内新生骨进行定量 BMD、BV/TV、Tb.Th 和Tb.Sp 分析 (n = 5)。

  图 7. 兔下颌骨缺损新生骨微观结构和血管化的组织学分析。A) 治疗 6 周和 12 周后兔下颌缺损的 H& E 染色和 B) Masson 三色染色。C) 缺损处 vWF 和 β-SMA 表达的共免疫荧光染色，以及 D) 植入后 6 周和 12 周时相应的血管半定量统计数据 (n = 3)。

  受到成骨时空线索的启发，本研究将 BMP-2 和超小型 CPO 纳入GelMA 前体中，开发出一种均质的有机-无机纳米墨水。通过基于投影的 3D 打印方法，使用所得纳米墨水构建了具有哈弗系统的皮质层和 TPMS 结构特征的松质层的分层支架。该支架拥有非常良好的生物相容性，在体外拥有非常良好的成骨和血管生成能力，转录组分析表明ITGA10/PI3K/AKT信号通路的激活可能是其分子机制。兔颅骨缺损修复模型证实，伴随着快速血运重建，仿生移植物诱导出结构良好的全层新生骨。更重要的是，FEA 根据结果得出，由这种分层移植物诱导的具有自然组织的新形成的骨骼有利于执行生物功能，集中在植入物周围的应力较低，并且具有更宽的负载共享区域。这一设计理念为开发功能导向的 3D 移植物提供了新颖的见解，旨在在临床应用中产生更好的功能结果。（文：SSC）